关键词:
纳米技术
酶辅助生物放大技术
电化学检测
结核诊断
摘要:
结核仍然是威胁人类健康的致死性传染病之一。根据世界卫生组织2019年的数据,全球有1000万人患上肺结核,其中145万人死亡。有力的结核检测手段可以在早期发现结核患者,有效地切断传播源,防止结核播散以及利于患者的早期治疗。目前结核的诊断主要依赖于患者痰液的抗酸染色,或者结核分枝杆菌的培养。然而,痰涂片的灵敏度和特异性较低,易出现假阳性。结核菌培养的特异性虽高,但是为了得到满意的培养结果通常需要2-4周的时间,将导致患者病情的延误。因此迫切需要开发新的结核诊断技术平台来满足结核早期、快速、准确检测的要求。电化学传感器技术,具有灵敏度高,特异性好,操作简单等优势,在疾病诊断,微生物检测,食品安全等诸多领域成为一种有前途的检测策略。基于以上考虑,本研究设计了两种电化学分析平台分别用于结核的核酸检测及抗原检测,以期为结核病的防控提供新思路。(1)聚苯胺(polyaniline,PAN)是一种常见的导电聚合物,由于优越的电传导性已经被广泛地应用在电化学传感中。然而除了其导电性以外,其本身的氧还原活性鲜被文献报道。这可能跟其氧化还原活性只能在酸性条件下显现有关,限制了其进一步应用。这里我们发现碳纳米材料可以显著改善聚苯胺在中性条件下的氧化还原活性,并首次合成了花状的碳纳米管-聚苯胺纳米簇,将其用作氧化还原探针同时用于产生和放大电信号。另外,功能化的富勒烯结合金纳米粒子用作传感界面可以大量固定捕获探针。为了进一步放大信号,基于Y型酶切的剪切酶辅助循环(endonuclease-assisted target recycling,EATR)也被引入到传感器的构建当中:辅助探针,捕获探针及靶标DNA能够自发的在传感界面组装成三元DNA结构,在酶的作用下,捕获探针被切割,释放出辅助探针和靶标DNA,进入下一个循环。将设计的传感器用于结核分枝杆菌符合群特异的IS6110核酸片段检测,其检测线为0.1 f M-10 n M,检测下限低至0.33 f M更重要的是,将其应用于结核患者的痰液PCR样本检测,取得了令人满意的结果。(二)我们首次合成了富勒烯-氮杂化碳纳米管-氧化石墨烯(C60/N-CNTs-GO)的复合纳米材料,通过进一步的研究发现,所构建的纳米材料,相较于富勒烯-碳纳米管可以显著改善富勒烯的空间分布性,充分暴露其活性位点,因此在四辛基溴化铵(TOAB)的刺激下可以产生更强的信号响应。同时,我们通过简单的表面改性策略,成功的将PEI修饰在铁基有机金属框架(Fe-MOF)表面,极大的改善了有机金属框架的导电性,用于金铂合金(Au@Pt)的固定,进行适配体的自组装。在经典的“三明治”夹心策略下,所构建的传感器成功的实现了在10 fg/m L-10 6fg/m L的范围内对结核特异性蛋白MPT64的定量检测,并且成功用于实际的结核血清学检测中。两种构建的方法均初步的概念验证中取得令人满意的结果,为今后进一步的临床实践应用打下了基础。