关键词:
循环肿瘤细胞
纳米技术
纳米囊泡
核酸适配体
光流控
微流控技术
摘要:
捕获和分析稀有的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是临床监测肿瘤转移和化疗效果的重要手段,外周血中CTCs作为转移的种子是肿瘤从原发灶扩散至远端器官的主要原因。精确分离循环肿瘤细胞(CTCs)对于癌症临床早期诊断和预后以及下游分析具有重要意义。研究人员已开发出许多不同种类的技术来分离和分析CTCs,包括基于CTCs表面标志的亲和性分离技术,以及利用CTCs的各种理化性质设计的无标记分离技术两大类,目前的趋势倾向于多种技术融合设计,因为每种单一方法都可能存在其固有缺点,比如对细胞亚群选择性偏倚,分离效率或捕获纯度低下亦或成本高昂操作复杂等问题,限制了这一认识和对抗肿瘤的重要途径真正地走向临床。目的:寻找新的更好的CTCs捕获技术或者将各种单一的技术融合起来,以达到更精准地、更有效率地捕获CTCs并对我们随后的细胞分析和培养更为有利的目的。本研究致力于建立具有生物相容性,能够最大限度保持目的细胞活性,灵活融合纳米技术、核酸适配体技术、荧光成像技术、肿瘤分子靶向技术、光镊(Optical tweezers)技术、微流控技术、显微操作技术的CTCs捕获方法。方法:本研究分为三个部分,在第一部分研究中,我们使用红细胞作为原材料制作了红细胞纳米囊泡并以此为基础设计了靶向肿瘤细胞的仿生型纳米囊泡,首先,在红细胞膜上修饰靶向肿瘤细胞表面叶酸受体的叶酸(folic acid,FA)分子和荧光素Cy5,然后使用脂质体挤出器将红细胞膜物理挤出制作成为具有FA和Cy5修饰的纳米囊泡(FA and Cy5-modified nanoscale vesicles,FRVs),用FRVs结合血液样本中用MCF7细胞系模拟的CTCs,然后通过显微操作系统,将肿瘤细胞进行分离收集;在第二部分中,我们同样使用FA修饰红细胞构建FA-RBCs,用FA-RBCs结合血中CTCs形成CC-RBCs(RBCs conjugated CTCs),使得此时的CTCs和其他血细胞之间产生明显的光学常数差异(体积大小和平均折射率),然后利用光流控分离系统在激光照射下精确分离经过修饰的CTCs,最后去掉红细胞回收CTCs;第三部分的研究中,我们使用前期筛选开发的靶向肝癌细胞的特异性核酸适配体LY1,结合特殊设计的微流控芯片装置,验证本套系统的捕获效能,分别对肝癌细胞系HCCLM9和肝癌患者的外周血样本进行了CTCs分离实验,并用免疫荧光技术和q RT-PCR技术对捕获到的细胞进行了初步的分子表达分析。结果:第一部分的研究中,我们成功建立了FRVs这一红细胞来源的纳米材料,在体外,FRVs可以特异性地靶向高表达FA受体的肿瘤细胞,然后利用显微操作进行高效、高纯度的CTCs捕获,捕获的肿瘤细胞具有较高的活性。在体内,FRVs可主动靶向肿瘤组织,聚集于肿瘤部位,表现出较强的Cy5荧光信号,可实现有效的肿瘤成像。此外,FRVs在体内没有发现毒性或副作用。因此,FRVs具有较高的临床应用潜力;第二部分的研究中,实验表明,CTCs能够被修饰后的红细胞有效结合,形成CC-RBCs(结合了RBC的CTCs)复合体,并最终以高纯度(超过92%)和高回收率(超过90%)从血液中分离出来。在整个过程中,CTCs被证明可以保持膜和功能的完整性。RBC捕获系统和光流控分离系统的结合将可能为癌症的早期诊断和治疗监测提供便利的工具;第三部分的研究中,我们验证了肝癌靶向核酸适配体LY1联合微流控芯片在人工模拟CTCs血样中的捕获效能,其捕获效率为89.1-92.4%,纯度55%以上,芯片上捕获的细胞与流出细胞相比其侵袭能力和致瘤能力以及部分分子表型有明显差别。对61名肝癌患者血样捕获到的CTCs研究表明,CTCs数量与疾病进展显著相关。并对19名转移或未转移肝癌患者CTCs在多种转移相关分子表达水平上的组间差异性进行了初步分析。