关键词：
肿瘤免疫治疗
铁代谢调控
生物矿化
先天免疫
纳米技术
摘要：
恶性肿瘤是一种免疫和代谢失衡疾病,通过开发针对肿瘤免疫和代谢的新型疗法有助于在杀伤肿瘤细胞的同时避免对正常细胞的损害,实现恶性肿瘤的高效低毒治疗。细菌膜中包含的微生物来源的组分可以有效激活机体先天免疫系统,因此利用基于细菌膜的免疫疗法可以为实体瘤的有效治疗带来新的思路。此外,异常增殖的肿瘤细胞对铁的需求高于正常细胞,这种对铁的依赖使得肿瘤细胞更容易发生铁代谢相关的死亡。基于此,本研究构建了一种细菌生物铁矿化生成生物膜包被的铁纳米颗粒,并评估了这种多功能的生物纳米材料诱导的机体免疫反应激活和肿瘤细胞铁死亡的联合抗肿瘤效果。（一）生物膜包被的铁纳米颗粒的制备及表征本研究利用了细菌内在的氧化还原反应合成了大肠杆菌包被的Fe3O4纳米颗粒,首先通过透色电子显微镜和能谱元素分析细菌培养过程中铁离子的价态、浓度和共孵育时间对铁纳米颗粒生成的影响,优化细菌生成铁纳米颗粒的条件。最终确定使用终浓度为200 m M的二价铁离子培养液和细菌共孵育22小时,可在细菌膜上观察到粒径均一的铁纳米颗粒,粒径约为10 nm。随后依次制备出了灭活的铁矿化大肠杆菌,铁矿化大肠杆菌菌影,铁矿化大肠杆菌内膜,铁矿化大肠杆菌内膜包被的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly-Lactic-co-Glycolic Acid,PLGA）,铁矿化金黄色葡萄球菌以及铁矿化金黄色葡萄球菌膜囊泡（Membrane vesicles,MV）。最后出于对生物安全性和多功能性的考虑,选择通过提取含有铁纳米颗粒的细菌内膜,用其包裹PLGA纳米颗粒,制备出含有铁和细菌内膜的多功能纳米颗粒（PLGA@E coli inner membrane-Fe3O4,PEF）。电镜结果显示PEF尺寸均一分散良好,没有聚集现象,外壳有黑色衬度,为黑色Fe3O4纳米颗粒。动态光散射结果表明,PEF粒径约为110 nm,电位约为-29.0 m V。在成功构建PEF后,本研究还制备了Fe3O4纳米颗粒（Fe3O4Nanoparticles,FN）以及修饰有Fe3O4的脂质体包被PLGA的纳米颗粒PLF（PLGA@Liposome-Fe3O4）,作为后续体内外研究的对照组。（二）PEF诱导先天免疫激活和铁死亡及其抗肿瘤效果评估本研究首先从体外水平评估了PEF诱导先天免疫激活和铁死亡的能力。将PEF和骨髓来源的树突状细胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells,BMDCs）共孵育,可以观察到大量负载有荧光染料的PEF被BMDCs摄取,同时,细胞培养上清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL12共五种细胞因子的分泌水平上升,BMDCs共刺激因子CD80和CD86表达上升,证明PEF可以被树突状细胞有效摄取并诱导先天免疫反应,促进DC细胞分泌促炎细胞因子和成熟。细胞毒实验结果显示PEF具有诱导肿瘤细胞死亡的效果,Western Blot结果也显示出GPx4和FACL4这两种铁死亡特征蛋白表达下调,侧面验证了铁死亡的发生。进一步地,我们构建了CT26结直肠癌荷瘤小鼠模型,以探索PEF的抗肿瘤治疗效果。结果显示当PEF为150 mg/kg（铁含量为0.8 mg/kg）时,对肿瘤细胞的杀伤效果最好。本研究还分析了PEF的协同抗肿瘤能力,实验结果表明,相较于单独诱导先天性免疫治疗组EF,单独铁代谢调控组FN以及PLF,PEF组的肿瘤治疗效果最好。H&E染色结果也显示,PEF组肿瘤部位坏死程度最高,初步证明了PEF调控先天免疫和铁代谢在肿瘤治疗的协同作用。同时,本研究还对PEF的生物安全性进行了评估,结果表明PEF对小鼠体重,脏器病理生理状态,血清中ALT,AST,BUN,CREA等肝肾功能指标以及小鼠的炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ和IFN-β等分泌均无明显影响,说明PEF具有良好的生物安全性。综上所述,本研究成功构建了一种含有细菌内膜和铁纳米颗粒的多功能纳米颗粒用于抗肿瘤治疗研究。一方面可以通过激活机体产生先天免疫反应,促进抗肿瘤效果;另一方面可以通过调节肿瘤细胞铁代谢,促进肿瘤细胞铁死亡。我们证明这种具有双重调控作用的新型纳米材料能够有效抑制肿瘤细胞生长,并具有良好的生物安全性,具备很好的临床应用潜力。
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