关键词：
吉西他滨
铁蛋白
透明质酸
纳米技术
骨肉瘤
摘要：
目的:
骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是来自间叶组织的恶性肿瘤,好发于生长代谢旺盛的未成年人,是儿童和青少年常见的原发性恶性肿瘤之一。由于骨肉瘤的恶性程度高、侵袭转移性强,通常在短时间内就会出现其他部位转移,最终导致患者死亡,给家庭以及社会带来了巨大负担。近年来临床上所采用的新辅助化疗联合保肢手术使得患者的预后出现明显的改善,患者的生存质量也显著提高。由于手术治疗术后极易复发,治愈率低,故术后辅助化疗对杀伤剩余肿瘤和防止肿瘤复发至关重要。但化学治疗常常诱发肿瘤患者产生抗药性,且许多患者因抗癌药物的毒副作用不得不终止治疗,因此,如何靶向治疗肿瘤一直是我们研究的热点。
近年来,有研究论述了纳米药物在抗肿瘤化学治疗中有很高的应用前景及价值,发现纳米药物不仅具有低毒、高效、缓释、长效、药物稳定性好、高分子载体无毒、不会长期积累在体内及不良反应小等优点,还具有更强的主动或被动靶向释放能力。铁蛋白作为生物体内负责铁代谢的基础蛋白,是一类天然的生物源性纳米材料,其典型的“笼”状结构内可装载抗肿瘤药物,将装载药物靶向带入高表达铁蛋白受体的肿瘤细胞内;同时,大量铁蛋白进入肿瘤细胞还会带入超过肿瘤细胞自身平衡耐受量的亚铁离子(Fe2+),诱发肿瘤细胞产生大量活性氧,破坏肿瘤细胞体内的蛋白质、核酸等物质,加大肿瘤杀伤效果。
本研究拟在此背景下创新性的将吉西他滨作为主药、铁蛋白作为载体,并辅以透明质酸作为协助靶向基团,联合制备出纳米级药物应用于OS治疗。其中,吉西他滨作为一种新的胞嘧啶核苷衍生物,属于脱氧核酸复制拮抗剂,近年来被证实可作为治疗实体瘤的一种强有力化疗方式;透明质酸能与肿瘤细胞表面高表达的透明质酸受体结合,与铁蛋白协同促进纳米药物通过胞饮作用进入骨肉瘤细胞内。本课题希望藉此研究为OS的治疗提供一种有效思路,也会后续的深层探究和方案改进提供理论依据。
材料和方法:
（1）透明质酸-铁蛋白携带吉西他滨（HFn-Gem-HA）纳米药物的制备、表征测试:配制吉西他滨（gemcitabine,Gem）、铁蛋白（H-ferritin,HFn）和透明质酸（hyaluronic acid,HA）的超纯水（ultrapure water,UP）溶液避光、冷藏备用。将Gem溶液溶于四氢呋喃（tetrahydrofuran,THF）环境中,通过旋转蒸发仪作用,不断去除溶剂THF,直至在圆底烧瓶底部形成一层纳米级白色薄膜（Gem）,然后取下圆底烧瓶放置于真空干燥箱中过夜,储存待用。
取出瓶底附有Gem薄膜的烧瓶,将HFn溶液逐滴滴入其中并不断搅拌,然后立即将此圆底烧瓶置于超声水浴振荡器中振荡并不断轻摇。待瓶底白色Gem颗粒完全溶于HFn溶液,用移液枪将含有纳米级Gem颗粒的HFn溶液分装进4毫升（milliliter,mL）离心管中,避光、冷藏备用。取出以上溶液,置于超声水浴振荡器中振荡激活,然后置于超声波细胞破碎仪中:首先高功率下破坏HFn蛋白的空间稳定使其笼状结构解离,接着在低功率下促进HFn蛋白的笼状结构复合,最终制备出载有Gem的铁蛋白（HFn-Gem）纳米药物溶液,冷藏、避光备用。
取出以上溶液用移液枪移入10 mL离心管中,置于超声水浴振荡器中振荡激活,同时缓慢滴入HA溶液,此过程中HA会与HFn-Gem之间产生共价结合,最终制备出表面修饰有HA并内部装载有Gem的HFn纳米级药物（HFn-Gem-HA）。为了验证HFn-Gem-HA的粒径及电势的实际大小,本课题运用紫外可见分光光度仪与马尔文激光粒度仪来开展测试,注意设置重复实验,相关数据使用均值±标准差表达。为了评估HFn-Gem-HA在血液中的稳定性,我们通过丁达尔效应验证。通过电子显微镜（Transmission ElectronMicroscope,TEM）扫描,评估并分析纳米颗粒的空间结构。通过体外释放实验观察HFn-Gem-HA纳米药物在模拟体液中释放Gem的72小时内动态变化情况。为了尽可能模拟出药物进入体内后的环境,我们预先配制出模拟血液内中性环境的酸碱度为p H=7.4溶液和肿瘤细胞溶酶体内酸性环境的酸碱度为p H=5.0溶液。通过芬顿反应实验分析HFn-Gem-HA纳米药物中的HFn是否仍可以催化产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）并诱导骨肉瘤细胞发生铁死亡,从而发挥其抗肿瘤效果。
（2）透明质酸-铁蛋白携带吉西他滨（HFn-Gem-HA）纳米药物的体外抗肿瘤测试:选择目前骨肉瘤研究常用的MG-63系和HOS系细胞进行复苏、传代,并根据后续实验需要实时扩增或冻存留种。MG-63系和HOS系细胞分别设置5组,即空白组（培养基）、Gem组、HFn组、HFn-Gem组和HFn-Gem-HA组。根据研究设计,HFn-Gem-HA主
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