摘要： 肿瘤疫苗递送系统研究厦门大学公共卫生学院分子影像暨转化医学研究中心、分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室刘刚教授课题组发现共刺激信号对肿瘤免疫耐受中T细胞功能重塑的重要机制，为个性化肿瘤疫苗研发提供理论依据和创新方法。相关成果发表于《自然·纳米技术》（NatureNanotechnology）。新制备的疫苗体系，因为其来源于工程化树突状细胞（DCs）母细胞表面与归巢效应相关的功能性趋化因子和黏附分子，

关键词： 纳米技术   合成生物学   仿生   基因工程   药物递送  

摘要： 合成生物学与纳米生物学的交叉融合业已成为促进生物技术与生物医药领域发展的重要方向之一。利用合成生物学技术可以帮助生物源性纳米材料创造特殊的结构与功能，驱动纳米生物学的发展。纳米技术的应用则可助力基因线路递送，提升基于合成生物学的生产效率；参与介导基因调控，拓展合成生物学技术的应用场景。合成生物学和纳米生物学的融合可以构建出纳米级功能模块和纳米人工杂合系统，增强改造后体系的功能。本文将着重介绍近期合成生物学和纳米生物学交叉融合的相关研究进展，从纳米技术为合成生物学的发展赋能、合成生物学成为助力纳米技术应用的新引擎以及合成生物学和纳米生物学融合发展这三个角度，着重阐述该领域近期的重点工作，剖析并展望相关技术在基因编辑、药物递送以及医学成像等生物医药领域的应用和前景。未来，合成生物学和纳米生物学的交叉融合可能朝着模块化、标准化、仿生化、功能集成化和智能化的方向进一步发展，为生物医药领域带来新的突破。

关键词： STING激动剂   纳米技术   肿瘤免疫治疗   免疫调控  

摘要： 目的和意义:目前癌症依然是危害人类健康的重大问题,而常规的治疗手段均存在一定的局限性。目前免疫疗法的兴起逐渐为肿瘤治疗带来希望,其中干扰素刺激因子（stimulator of interferon genes,STING）激动剂被证明具有强大的抗肿瘤效果,在肿瘤免疫治疗领域受到极大关注。STING是固有免疫中的一个重要信号蛋白,在肿瘤微环境中,STING可以被2',3'-环磷酸鸟苷-腺苷（2',3'-cyclic GMP-AMP,2',3'-c GAMP）激活并通过释放I型干扰素（type I interferon,IFN-I）,启动机体的固有免疫应答及适应性免疫应答,最终达到抗肿瘤的目的。然而目前小分子STING激动剂2',3'-c GAMP易被酶分解并代谢清除。随着纳米药物技术的发展,为开发新型STING激动剂提供了一个新方向,对肿瘤免疫治疗提供更强有力的支持。方法:基于STING自身结构特点,我们首先采用高温热解法合成超小尺寸FeO纳米颗粒（nanoparticles,NPs）,利用透射电子显微镜及动态光散射检测仪分析纳米颗粒的尺寸、均一性、稳定性。并利用FeO纳米颗粒表面的金属配位能力修饰腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotide,AMP）与鸟嘌呤核苷酸（guanylate,GMP）模拟2',3'-c GAMP分子,并把该纳米颗粒定义为“NanoGAMP”。其次在细胞水平层面,通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q PCR）、蛋白印迹技术、流式细胞分析技术验证NanoGAMP对STING通路是否具有激活能力。最后通过建立小鼠结直肠癌（MC38）皮下移植瘤模型评估NanoGAMP的抗肿瘤治疗效果,并进行生物安全性评价。结果:通过透射电子显微镜及动态光散射检测仪分析显示FeO纳米颗粒尺寸均一、大小在2 nm左右、稳定性较好。在细胞水平层面,通过对I型干扰素、趋化因子10、白介素6的基因表达水平分析表明NanoGAMP相对于2',3'-c GAMP而言,其诱导STING通路激活的能力更强,蛋白印迹技术也同样证明NanoGAMP对STING下游通路的激活,流式细胞分析技术验证了NanoGAMP能够促进树突状细胞（dendriticcells,DCs）表面CD80、CD86的表达的提高,有利于促进树突状细胞的抗原提呈。最后,在动物水平方面,NanoGAMP能够有效地抑制小鼠MC38肿瘤的生长,且能够促进肿瘤组织中CD4T、CD8T细胞的活化、IFN-γ、TNFα等细胞因子的表达,最后对小鼠血清生化指标进行检测,表明NanoGAMP具有较好的生物安全性。结论:本文的研究表明,我们根据STING自身结构特点,采用高温热解法已成功合成能激活STING通路的超小尺寸仿生纳米STING激动剂,并具有较好的抗肿瘤治疗效果。此项研究工作可能为STING激动剂的研发及肿瘤的免疫治疗提供新思路。

关键词： 帕金森病   纳米技术   治疗  

摘要： 帕金森病是一种复杂的神经退行性疾病，目前临床上对帕金森病常用的治疗方法有多巴胺药物治疗和脑深部电刺激疗法等，科研人员也在不断探索一些新疗法。近日，中国研究团队通过研究实验发现，运用聚乙二醇（PEG）修饰的二维纳米材料P-sheet可以从根本上抑制神经元丧失，从而有效缓解帕金森病运动功能障碍。

关键词： 纳米技术   免疫治疗   结直肠癌   术后复发   长非编码RNA  

摘要： 背景:结直肠癌(CRC)的术后复发和转移导致患者预后不良,亟需开发一种安全有效的术后治疗策略。免疫治疗由于毒副作用小、能靶向杀死肿瘤、生成免疫记忆响应,得到越来越多的关注。此外,近年研究发现,长非编码RNA浆细胞瘤变异异位基因1(Pvt1)介导CRC的发生发展和肿瘤微环境(TME)中的免疫抑制。利用纳米技术负载药物能有效提高其生理稳定性和进胞效率,更重要的是,仿生纳米粒子不仅具有同源靶向性而且含有肿瘤相关抗原(TAAs)以激活抗肿瘤特异性免疫响应。基于此,本研究开发了一种搭载靶向lnc RNA Pvt1的仿生纳米粒子的生物支架介导三重免疫响应以抑制CRC术后复发和转移。 方法:为了制备该生物支架,首先以Pvt1为靶点设计并构建针对Pvt1的短发夹RNA质粒(记为“shPvt1”),随后提取小鼠CRC细胞系CT26细胞的细胞膜(记为“CM”)。通过将shPvt1、CM、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP,记为“D”)与胆固醇共混自组装并反复膜挤压得到纳米粒子shPvt1-CM-D。进一步,将shPvt1-CM-D与化疗药物奥沙利铂(记为“Oxa”)共同包裹于基于海藻酸钠(OA)和透明质酸(HA)的水凝胶中,制得生物支架shPvt1-CM-D/Oxa@gel。之后,通过透射电镜和扫描电镜对该支架进行形貌表征,并用原子吸收光谱、荧光标记示踪实验检测支架搭载药物的释放速率。为了验证该生物支架所介导的三重免疫响应,分别进行了流式分析、ELISA分析和细胞共培养实验,以检测肿瘤细胞中损伤相关分子模式(DAMPs)的释放、骨髓来源树突状细胞(BMDCs)表面CD80/CD86的表达以及粒细胞髓源抑制细胞(G-MDSC)对T细胞免疫抑制的缓解。最后在小鼠体内构建了CRC术后原位复发模型、术后异位二次侵袭模型、异时性肝转移模型和术后同时性远处转移模型,并将该生物支架移植于手术部位,以探究其对CRC术后复发和转移的抑制效果。 结果:合成可高效搭载shPvt1的仿生纳米粒子shPvt1-CM-D(直径约270 nm),并将其包裹于OA/HA的水凝胶支架中。该生物支架在体内条件下可缓慢降解,并持续释放Oxa和shPvt1-CM-D分别达5天和10天,以介导三重免疫响应重塑TME:1)shPvt1-CM-D增强了Oxa诱导的免疫原性细胞死亡(ICD)作用,进一步促进了肿瘤中钙网蛋白(CRT)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的释放;2)shPvt1-CM-D与Oxa联合增强的ICD与CM中的TAAs共同刺激DCs,促进其表面CD80/CD86的上调与TNF-α、IL-6的分泌;3)shPvt1-CM-D抑制了G-MDSCs中活性氧(ROS)与精氨酸酶(Arg)的分泌,削弱了其诱导的T细胞耗竭。在动物实验中,与Oxa@gel,CM-D@gel和shPvt1-CM-D@gel组相比,shPvt1-CM-D/Oxa@gel组小鼠原位复发肿瘤得到最显著的抑制,且8只小鼠中有5只在60天时仍未观察到肿瘤复发,生存率达62.5%。同时,shPvt1-CM-D/Oxa@gel可诱导小鼠产生特异性免疫记忆,抵御CRC的再次侵袭,尤其是异时性肝转移。另外,shPvt1-CM-D/Oxa@gel还可通过激活系统性免疫响应抑制同时性远处转移。 结论:本研究成功构建了一种搭载靶向lnc RNA Pvt1的仿生纳米粒子的生物支架,可有效地抑制CRC术后原位复发及远处转移,为靶向lnc RNA的CRC术后免疫治疗提供新思路。

关键词： 胶质母细胞瘤   多药联合   铁死亡   纳米药物   纳米技术  

摘要： 胶质母细胞瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤,采用手术、放疗和化疗等综合性治疗策略后,治愈率仍较低且术后容易复发,患者预后差。虽然免疫治疗和细胞治疗等新疗法相继问世,但在临床试验中鲜有成效。胶质母细胞瘤的治疗涉及血脑屏障、免疫逃逸、瓦博格效应、细胞异质性等挑战,探索和构建针对胶质母细胞瘤生物学特点的药物对于克服上述困难极为重要,相关疗法有望突破胶质母细胞瘤的治疗瓶颈,达到延长患者生存期的目标。药物联合疗法在治疗胶质母细胞瘤时显示出诸多益处,多药联合可发挥药物最大抗肿瘤效果的同时,显著降低全身的毒副作用,并克服由单一药物引起的肿瘤细胞耐药性的产生。构建纳米药物是实现多药联合的理想途径,在纳米载体的协助下,不同治疗药物可协同整合于载体内,提高所搭载药物的疗效和安全性。相较于传统化疗药物,纳米药物合成作为最具创新性的药物研发领域,在抗胶质母细胞瘤方面展现出以下优势。首先,针对胶质母细胞瘤药物递送差的问题,纳米药物优势表现在以下三方面:(1)纳米制剂可促进药物通过血脑屏障;(2)直径小于200纳米的纳米药物可依靠增强渗透性和保留效应以实现肿瘤局部富集;(3)肿瘤靶向配体的修饰可使纳米药物与细胞表面高表达的受体结合,提高肿瘤细胞主动摄取能力。在克服胶质母细胞瘤异质性和细胞耐药性方面,纳米药物可通过以下途径实现治疗目标:(1)通过促进细胞内吞提高化疗药物的疗效;(2)提高肿瘤放射致敏作用,增加放射治疗效果;(3)激活抗肿瘤免疫细胞,如T细胞、NK细胞的抗肿瘤作用;(4)抑制肿瘤血管生成;(5)辅助术者明确肿瘤边界以方便手术切除;(6)药物可逃避机体的监测/防御系统进入肿瘤内部;(7)恢复肿瘤细胞死亡途径。本文的目的是探索多重靶向纳米药物的合成方法及其在治疗胶质母细胞瘤中的作用机制,并对比其与非纳米药物治疗相比的优势。本研究主要设计和构建的两种纳米药物,分别从不同角度进行了药物组合和治疗,两种治疗模式均着眼于解决上述问题和实现上述治疗目标。第一章中,我们设计和构建了基于氧化铁纳米颗粒的多靶点协同纳米药物FA/Pt-si-GPX4@IONPs,该纳米药物能有效递送递铁、顺铂和谷胱甘肽过氧化物酶4的小干扰基因,从而高效地协同诱导肿瘤细胞发生铁死亡和凋亡。除肿瘤局部注射外,该纳米制剂通过表面修饰的叶酸配体显著提高了肿瘤细胞主动摄取效率。所搭载的治疗药物通过诱导两种细胞死亡模式,克服了肿瘤异质性和细胞耐药性的问题,增强了各联合药物的综合治疗效果,并且降低了静脉注射引起的毒副作用。第二章中,针对第一章治疗所发现的问题和弊端,如局部注射给药方式较难操作且与临床实际应用存在差异的问题,第二章着重于构建可穿透血脑屏障的纳米药物,通过控制药物尺寸使其更容易穿过受损的血脑屏障,除此之外,靶向基团cRGD也可增加肿瘤细胞的摄取,两种途径均可提高肿瘤部位的药物浓度。针对肿瘤异质性和细胞耐药性的问题,所合成的纳米药物RPDGs搭载了更多药物,即多柔比星、四价铂药和没食子酸,显著提高了联合治疗效果。值得注意的是,与FA/Pt-si-GPX4@IONPs相比,RPDGs在诱导肿瘤细胞发生铁死亡的效率方面效果显著提高,具有更好的治疗效果。综上所述,本研究构建的两种诱导铁死亡的多重靶向纳米药物,克服了胶质母细胞瘤血脑屏障、肿瘤异质性和耐药性的弊端,突破了传统药物治疗效果差且全身毒副作用大的瓶颈,显著提高了药物的治疗效果,为胶质母细胞瘤治疗性药物的开发和构建提供了新思路。

关键词： 高熵合金   纳米技术   电子结构   储能   能源催化   理论计算  

摘要： 近年来,由于高熵合金在力、热、电、磁、抗腐蚀等多个领域展现出的优异性质和巨大潜力,引起了全世界相关领域内的广泛关注。随着对高熵合金的逐渐了解以及高熵合金纳米材料的合成,研究人员们发现这种材料特有的高熵效应和奇特的鸡尾酒效应,使其同样在催化领域内具有优越的性能表现。然而,目前高熵合金的研究主要集中在机械、抗腐蚀等领域,对于高熵合金纳米材料的制备及其在能源等领域的应用探索仍然较少,对于高熵合金电子结构等性质的认识仍然不足。为了进一步开展新能源利用及储能技术的开发,合成更加高效、经济的材料以及探讨能源利用中的理论机理对于分布式能源的推广意义重大。因此,高熵合金电子结构以及其在储能、能源催化中的应用值得进一步研究。本研究立足于供热、供燃气、通风及空调工程学科中所涉及的分布式能源领域,从实验和理论两个层面出发,通过开发简单可控的合成技术制备均一高熵合金纳米颗粒,结合先进表征技术分析高熵合金的物理化学性质在储能及产氢中的影响因素,并根据理论建模深入探讨高熵合金电子结构性质及高熵合金性能作用机制。研究内容主要包括以下五个方面:（1）开发高熵合金纳米材料的制备技术。分别利用碳热冲击法、热解还原法、速热速冷法制备高熵合金纳米复合材料。碳热冲击法:以聚丙烯腈为原料通过静电纺丝技术制备取向性纳米纤维,然后通过预稳定和碳化手段获得取向性碳纤维基底。将不同金属氯化物混合溶液添加到纳米碳纤维基底后。在氩气手套箱中,利用碳热冲击法制备得到了负载在碳纳米纤维上的高熵合金纳米颗粒材料。制备的多种高熵合金纳米颗粒具有20 nm左右的颗粒直径和良好的均一性。热解还原法:通过热解和氢气还原鸟嘌呤和硝酸盐混合物制备了负载在无定型碳上的高熵合金纳米颗粒。速热速冷法:通过速热速冷法制备了负载在生物质炭上的高熵合金纳米颗粒。将废弃生物质软木塞通过碳化和活化后获得富氮生物质多孔碳。并在生物质炭上,制备得到粒径均一性好、可控的高熵合金纳米颗粒。（2）探究高熵合金的电子结构位移现象。为了研究高熵合金系统中的电子结构,通过碳热冲击和原位还原方法在两种不同的碳基板上合成了高熵合金纳米颗粒。采用X射线光电子能谱分析和第一性原理电子结构计算,研究了五元高熵合金各组分的芯能级正负位移与电子密度变化的关系。其中,铜的芯能级位移约为-0.3 e V,而铁、钴、镁、铬和锰的芯能级位移为正。结合实验数据与Bader电荷计算结果发现,这些元素的芯能级位移现象源自原子间的电荷转移。此外,虽然实验显示镍的核心能级偏移明显为正,但通过态密度计算分析显示,这是由费米能级的偏移引起的。研究结果表明,合金中的电子密度再分布在较少的电负性元素和较强的电负性元素间发生,不同元素之间的电子转移导致了合金中的电子结构改变。这对于指导高熵合金的设计,扩展其在机械,医学,催化和能量储存、转换方面的潜在应用具有重要意义。（3）探索高熵合金在超级电容器中的应用。通常异质结的纳米颗粒/碳质纳米材料能够促进电极/电解质界面上的传质和电荷转移,进而在超级电容器储能中具有优异的表现。然而,高熵合金纳米颗粒材料在超级电容器中的应用几乎没有报道。本研究首次利用碳热冲击法在超级取向电纺碳纳米纤维上合成均匀高熵合金纳米颗粒。这种方法的关键是将取向碳纳米纤维的排列方向与合适的电脉冲电流方向耦合,其中电流方向沿着纤维的方向进行电脉冲更有利于高熵合金的形成。对于电化学性能,金属氯化物盐溶液浓度为5 m M的Fe Ni Co Mn Mg HEA-NPs/ACNFs电极表现出203 F/g的高电容和21.7Wh/kg的比能量密度。2000次循环后的HEA-NPs/ACNFs仍然具有较好的充放电效率,结合实验后的微观结构表征结果,高熵合金纳米颗粒复合碳纤维材料具有优异稳定性。这些发现为HEA-NPs/碳质纳米材料作为储能应用提供了重要参考和指导。（4）探索高熵合金在电解水制氢中的应用。长期以来,贵金属因其优异的性能和稳定性在电化学反应中发挥着重要作用。然而,材料的高成本限制了贵金属催化剂的应用。高熵合金材料的发展为我们提供了一种将高性能与低成本相结合的可行途径,通过调整电催化剂的电子结构来获得高性能的电催化剂,实现高效地电解水反应。因此,在碳纳米纤维上合成了含钌的高熵合金纳米颗粒。其中,Ru0.2@CNFs表现出最佳的催化反应性能和1000次循环的优异稳定性。此外,通过高熵合金的理论建模和计算分析了态密度和d带中心,表明Ru0.2@CNFs具有优异的电催化潜力,这可能得益于高熵效应导致原子间更强的电子相互作用。Ru0.2高熵合金的最大构型熵合理地解释了OER电催化的显著稳定性。此外,高熵合金与反应物之间的吸附能在-0.44 e V至-0.52 e V范围内,结果表明高熵合金表面上具有丰富的活性位点。因此,高熵合金复合材料可以在实际应用中作为潜在的少贵金属

关键词： 肿瘤微环境   耐药性肿瘤治疗   脂质过氧化物   铁死亡   纳米技术   脂质体  

摘要： 细胞凋亡功能障碍是导致肿瘤耐药性的主要机制之一。因此,引发非凋亡的细胞死亡是克服肿瘤耐药性的有效途径。细胞铁死亡是近年来发现的一种通过细胞氨基酸、脂质以及铁离子代谢调节而引发的细胞程序性死亡。铁死亡不依赖于凋亡的关键信号分子(如caspase3/7,Bcl-2等),主要受GPX4、FSP1和DHODH等核心蛋白的调控。已有研究表明,肿瘤细胞可能对细胞铁死亡的引发剂敏感。因此,该论文提出了引发细胞铁死亡以克服肿瘤耐药性的科学假设。本研究主要围绕如何引发肿瘤细胞铁死亡这一关键科学问题,提出了肿瘤富氧联合X射线引发脂质过氧化反应,过氧化脂质体靶向癌细胞溶酶体导致铁离子代谢紊乱两种新策略,以黑色素瘤和乳腺癌荷瘤小鼠为研究模型,取得了以下研究结果: 1)构建了持续性、可控型产氧微工厂(PMCs),用于改善实体瘤的乏氧微环境。通过逐步改变培养温度(25-37℃)和培养基成分(0-90%RPMI-1640),获得了蓝藻驯化株(e-S.7942),利用蓝藻e-S.7942、上转换纳米材料(UCNPs)以及海藻酸钠凝胶在静电场下制备了 PMCs微球,同时确定了 PMCs的最优组成成分比例为1×106的e-S.7942和0.7 μg的UCNPs,最后发现PMCs的产氧能够使溶液含氧量从1.6 mg/L(乏氧溶液)上升至7.3 mg/L(富氧溶液,hyperoxia),并改善90%的细胞乏氧。 2)X射线结合PMCs引发脂质过氧化,导致细胞铁死亡,克服了黑色素瘤的耐药性。在PMCs使肿瘤内的氧含量从10.9 mmHg(乏氧环境)上升至33.1 mmHg(富氧环境)后,联合应用X射线治疗黑色素瘤时发现,该联合治疗策略通过产生羟自由基(·OH),引发细胞膜脂质过氧化反应,造成细胞内脂质过氧化物堆积,触发细胞铁死亡,从而治疗耐药性黑色素瘤。同时,动物实验验证了该联合治疗策略能够有效的抑制肿瘤生长和转移,从而使荷瘤鼠的生存率提高至50%。 3)发现了过氧化脂质体(liposome-OOH)引发细胞铁死亡的机制。首先制备了一种过氧化物功能化的脂质体纳米材料;然后,利用11种不同类型肿瘤的耐药性细胞评价了liposome-OOH的抗肿瘤效果;同时,阐述了liposome-OOH治疗耐药性肿瘤机制是通过靶向细胞溶酶体,干扰Fe2+代谢,造成细胞内脂质过氧化产物堆积、GSH消耗、GPX4蛋白表达下降,从而引发细胞铁死亡; 4)过氧化脂质体(liposome-OOH)有效改善了耐药性乳腺癌小鼠的生存率。利用DOX耐药的4T1乳腺癌细胞构建了原位乳腺癌动物模型;在给予静脉注射liposome-OOH治疗耐药性乳腺癌荷瘤鼠时发现,liposome-OOH能够明显抑制耐药性乳腺癌的生长和肺转移,使荷瘤鼠的生存时间从38天至少延长至60天,并将荷瘤鼠的生存率提高至90%。 综上所述,本研究主要获得了以下结论:1)PMCs能够创造富氧微环境,改善肿瘤细胞乏氧状态;2)联合PMCs和X射线治疗通过引发脂质过氧化作用,触发细胞铁死亡,从而治疗耐药性黑色素瘤;3)liposome-OOH通过靶向细胞溶酶体,干扰Fe2+代谢,引发细胞铁死亡,克服多种耐药性肿瘤。本论文研究内容具有以下科学意义:1)利用PMCs光合作用产氧为改善肿瘤乏氧微环境提供了一种新思路;2)联合PMCs和X射线治疗为耐药性肿瘤的治疗提供了一种新策略;3)liposome-OOH作为一种铁死亡引发剂为耐药性肿瘤治疗提供了一种新型纳米药物。

关键词： 蛋白质包封   纳米容器   货物释放   生物纳米技术  

摘要： 来自超嗜热菌的由二氧四氢喋啶合酶形成的十二面体蛋白质衣壳(AaLS),作为纳米容器在生物纳米技术应用领域引起了人们的极大兴趣。在自然界中,AaLS作为一种酶的纳米容器,通过封装核黄素合成酶(AaRS),催化核黄素生物合成途径的最后两步。研究发现,AaRS(AaRS12)的C端由最后12个氨基酸组成的短肽可以作为包封标签,介导蛋白质在微生物体内被AaLS衣壳包封。在大肠杆菌中共表达后,与AaRS12融合的蛋白能够被AaLS包封。然而,AaLS衣壳很稳定,并且在非变性条件下不能释放蛋白质客体,这限制了该衣壳在一些领域如药物递送方面的应用。 此前,AaLS的一种变体,称为AaLS-switch-p H,可以根据溶液p H的变化,可逆地解聚和重聚。相较于野生型衣壳,AaLS-switch-p H引入了五个点突变,其中3个点突变位于内表面。这些突变可能会破坏AaRS12包封标签与衣壳内部的结合。在这项研究中,我测试了AaLS-switch-p H包封一个模型蛋白的能力,即融合在AaRS12肽上的绿色荧光蛋白(GFP-AaRS12)。在衣壳和蛋白质货物在大肠杆菌中共表达后,纯化的AaLS-switch-p H衣壳具有大量的绿色荧光,这表明蛋白质客体被包裹在衣壳内。此外,SDS-PAGE分析显示,与GFP-AaRS12共表达后,纯化的AaLS-switch-p H衣壳复合物中出现了GFP条带,进一步证明了GFP-AaRS12与AaLS-switch-p H形成了衣壳复合物。SEC分析显示,AaLS-switchp H衣壳内客体蛋白的存在对衣壳的形态和大小没有影响。荧光强度表明,每摩尔衣壳平均含有0.34摩尔GFP-AaRS12,其包封率比野生型AaLS衣壳的包封率低28%。因此,AaLS-switch-p H衣壳可以在体内包封AaRS12标记的蛋白客体,但包封率有所降低。 AaLS-switch-p H衣壳可以在体外由五聚体聚合形成。我尝试在体外衣壳组装过程中,将GFP-AaRS12包封入AaLS-switch-p H衣壳中。在组装反应后,经SEC分析,GFP-AaRS12的存在不影响AaLS-switch-p H在体外自组装。然而,对荧光强度检测发现,在不同浓度的GFP-AaRS12的存在下重新组装并重新纯化的AaLS-switch-p H衣壳,没有显著包封GFP-AaRS12的能力。因此,对于AaLSswitch-p H,与AaRS12融合的蛋白客体的体外包封效率比体内低得多。 在体内包封客体蛋白后,GFP-AaRS12可以在体外通过降低p H从AaLSswitch-p H衣壳中释放出。将纯化的AaLS-switch-p H:GFP-AaRS12包封复合物的p H从8.0调节到5.7,SEC和荧光分析发现,AaLS-switch-p H解聚得到的五聚体不再与GFP-AaRS12客体相结合。而相比之下,经过相同的处理后,野生型AaLS:GFP-AaRS12包封复合物依然保持完整衣壳的形态。因此,GFP-AaRS12在p H值为5.7时无法从野生型AaLS中释放出来,这可能是因为野生型衣壳在该条件下没有解聚。对于AaLS-switch-p H,在p H值达6.5时观察到依然有部分GFP-AaRS12从衣壳中释放,而在p H 7.0时AaLS-switch-p H:GFP-AaRS12包封复合物保持完整的衣壳形态。此外,在p H 8.0和4℃的条件下长期储存后,发现没有导致GFP-AaRS12从AaLS-switch-p H中明显释放,表明这种包封复合物在这些条件下是稳定的。 先前的工作试图鉴别可以替代AaRS12的肽,使其通过AaLS-switch-p H封装蛋白质客体。通过噬菌体展示技术,筛选出一系列由12个氨基酸组成的肽,它们能够与AaLS-switch-p H的五聚体形式结合。在这些筛选出的肽中,我测试了其中两种肽将GFP包封入AaLS-switch-p H衣壳中的能力。在细胞中与GFPPD12.1共表达后,纯化的AaLS-switch-p H衣壳没有显示出明显的荧光,这表明PD12.1无法在体内将蛋白客体靶向引入AaLS-switch-p H衣壳中。此外,我也尝试了在体外将GFP-PD12.1和GFP-PD12.2包封入AaLS-switch-p H中。在GFPPD12.1或GFP-PD12.2存在下组装并重新纯化AaLS-switch-p H衣壳后,未检测到该衣壳有明显的荧光,这表明PD12.1和PD12.2在体外不能将货物蛋白引入到AaLS-switch-p H衣壳内。因此,噬菌体展示技术筛选出的肽无法作为AaLSswitch-p H的包封标签。 总而言之,AaLS-switch-p H能够在体内包封AaRS12标记的客体蛋白,

关键词： 巨噬细胞   铁死亡   纳米技术   肿瘤疫苗   免疫治疗  

摘要： 背景:全球肿瘤的发病率和死亡率持续增长,实体瘤的复发和转移是导致患者死亡的重要原因之一。肿瘤治疗策略包括直接杀伤肿瘤和间接调节肿瘤微环境,以增强肿瘤细胞对治疗策略的敏感性,而直接与间接疗法之间存在协同作用。免疫疗法极具临床应用潜能,可激活患者自体免疫系统以对抗癌症。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤微环境中至关重要,主要分为促肿瘤生长的M2型和少量的炎性抗肿瘤M1型巨噬细胞。因此将TAMs重塑为“免疫刺激性”的M1表型,对肿瘤微环境的逆转具有重要意义。针对肿瘤的局部抑制、原位复发和远端转移,本研究构建了2种治疗体系,以期为肿瘤联合疗法及免疫疗法带来新的突破。在第1种治疗体系中,我们基于纳米技术设计制备了新型多功能纳米治疗平台。目的:以超顺磁氧化铁纳米颗粒为核心,采用仿生纳米水凝胶进行表面修饰,并有效负载免疫佐剂Cp G ODNs和化疗药物DOX,构建免疫调节、肿瘤铁死亡及化疗的三重协同肿瘤治疗策略,揭示其协同治疗增效机制。方法:氧化铁纳米颗粒的制备;复合纳米颗粒的制备;动态光散射(DLS)、透射电镜、紫外吸收光谱等表征粒径、形貌、载药率。激光共聚焦显微镜观察不同条件下纳米颗粒的内吞及分布情况;CCK8试验、流式细胞术研究纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤及联合治疗效应;过氧化氢检测、流式细胞术、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等探究巨噬细胞重塑效应;CCK8试验、流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光等研究纳米颗粒对肿瘤细胞铁死亡诱导效应。动物水平抑瘤效应研究:肿瘤生长曲线、免疫荧光、H&E染色等验证原位肿瘤的抑制及铁死亡诱导效应;流式细胞术验证纳米颗粒对肿瘤微环境巨噬细胞重塑及全身免疫调节效应。复发与远端模型:肿瘤生长曲线、流式细胞术验证纳米颗粒对复发和远端肿瘤的抑制及免疫记忆效应;血液转移模型:小动物活体成像、H&E染色等验证纳米颗粒抑制肿瘤血液肺转移效应。结果:复合纳米颗粒具有肿瘤微环境响应性,M2型巨噬细胞重塑为肿瘤杀伤性M1型的效应,改善免疫抑制微环境,并增强化疗敏感性,高效杀灭肿瘤细胞;氧化铁磁颗粒可诱导肿瘤细胞发生铁死亡,激活适应性免疫应答和长效免疫效应,从而抑制肿瘤的局部生长、原位复发和远端转移。结论:该治疗体系有效证明免疫细胞调节、肿瘤铁死亡和化学疗法的协同作用可作为一种新型的肿瘤治疗方式,为临床肿瘤免疫治疗提供新思路。在第2种治疗体系中,我们基于天然源生物活性材料设计开发了一种可植入式多功能肿瘤疫苗,用于实体瘤的预后治疗。目的:以M1型巨噬细胞和肿瘤细胞的融合细胞膜,与免疫佐剂Cp G-ODNs共同装载到水凝胶,制备为植入式肿瘤疫苗FM+@N,探究疫苗的免疫调节及肿瘤复发抑制效应。方法:PEG经典细胞融合法融合小鼠骨髓来源的M1型巨噬细胞和4T1乳腺肿瘤细胞,梯度离心分离法获得融合膜,钙离子物理交联成胶法制备肿瘤疫苗FM+@N。荧光成像、流式细胞术、免疫印迹等验证融合细胞;CCK8试验、流式细胞术、荧光成像研究融合膜对肿瘤细胞的杀伤效应;流式细胞术、免疫印迹、酶联免疫吸附测定等探究巨噬细胞重塑效应;流式细胞术验证融合膜抗原呈递效应;成像、扫描电镜、溶胀实验、CCK8试验等验证疫苗的成功制备。动物水平抑瘤效应研究:肿瘤生长曲线、小动物活体成像、免疫荧光、H&E染色等验证原位复发肿瘤抑制效应;流式细胞术验证肿瘤疫苗对肿瘤微环境巨噬细胞重塑及全身免疫调节效应。远端模型:肿瘤生长曲线、流式细胞术验证肿瘤疫苗对远端肿瘤的抑制、巨噬细胞重塑、免疫记忆效应。结果:肿瘤疫苗作为有效的“免疫分子库”,将M2型肿瘤相关巨噬细胞重塑为M1型,促进树突状细胞(DCs)的抗原递呈作用,增强T淋巴细胞浸润,改善肿瘤内免疫抑制微环境,高效激活适应性免疫应答及记忆性免疫效应。结论:该治疗体系采用同种异体化细胞融合膜,制备了具有免疫调节功能的天然肿瘤疫苗,降低实体瘤术后复发和转移风险,未来有望实现临床转化。