关键词：
蛋白质包封
纳米容器
货物释放
生物纳米技术
摘要：
来自超嗜热菌的由二氧四氢喋啶合酶形成的十二面体蛋白质衣壳(AaLS),作为纳米容器在生物纳米技术应用领域引起了人们的极大兴趣。在自然界中,AaLS作为一种酶的纳米容器,通过封装核黄素合成酶(AaRS),催化核黄素生物合成途径的最后两步。研究发现,AaRS(AaRS12)的C端由最后12个氨基酸组成的短肽可以作为包封标签,介导蛋白质在微生物体内被AaLS衣壳包封。在大肠杆菌中共表达后,与AaRS12融合的蛋白能够被AaLS包封。然而,AaLS衣壳很稳定,并且在非变性条件下不能释放蛋白质客体,这限制了该衣壳在一些领域如药物递送方面的应用。此前,AaLS的一种变体,称为AaLS-switch-p H,可以根据溶液p H的变化,可逆地解聚和重聚。相较于野生型衣壳,AaLS-switch-p H引入了五个点突变,其中3个点突变位于内表面。这些突变可能会破坏AaRS12包封标签与衣壳内部的结合。在这项研究中,我测试了AaLS-switch-p H包封一个模型蛋白的能力,即融合在AaRS12肽上的绿色荧光蛋白(GFP-AaRS12)。在衣壳和蛋白质货物在大肠杆菌中共表达后,纯化的AaLS-switch-p H衣壳具有大量的绿色荧光,这表明蛋白质客体被包裹在衣壳内。此外,SDS-PAGE分析显示,与GFP-AaRS12共表达后,纯化的AaLS-switch-p H衣壳复合物中出现了GFP条带,进一步证明了GFP-AaRS12与AaLS-switch-p H形成了衣壳复合物。SEC分析显示,AaLS-switchp H衣壳内客体蛋白的存在对衣壳的形态和大小没有影响。荧光强度表明,每摩尔衣壳平均含有0.34摩尔GFP-AaRS12,其包封率比野生型AaLS衣壳的包封率低28%。因此,AaLS-switch-p H衣壳可以在体内包封AaRS12标记的蛋白客体,但包封率有所降低。AaLS-switch-p H衣壳可以在体外由五聚体聚合形成。我尝试在体外衣壳组装过程中,将GFP-AaRS12包封入AaLS-switch-p H衣壳中。在组装反应后,经SEC分析,GFP-AaRS12的存在不影响AaLS-switch-p H在体外自组装。然而,对荧光强度检测发现,在不同浓度的GFP-AaRS12的存在下重新组装并重新纯化的AaLS-switch-p H衣壳,没有显著包封GFP-AaRS12的能力。因此,对于AaLSswitch-p H,与AaRS12融合的蛋白客体的体外包封效率比体内低得多。在体内包封客体蛋白后,GFP-AaRS12可以在体外通过降低p H从AaLSswitch-p H衣壳中释放出。将纯化的AaLS-switch-p H:GFP-AaRS12包封复合物的p H从8.0调节到5.7,SEC和荧光分析发现,AaLS-switch-p H解聚得到的五聚体不再与GFP-AaRS12客体相结合。而相比之下,经过相同的处理后,野生型AaLS:GFP-AaRS12包封复合物依然保持完整衣壳的形态。因此,GFP-AaRS12在p H值为5.7时无法从野生型AaLS中释放出来,这可能是因为野生型衣壳在该条件下没有解聚。对于AaLS-switch-p H,在p H值达6.5时观察到依然有部分GFP-AaRS12从衣壳中释放,而在p H 7.0时AaLS-switch-p H:GFP-AaRS12包封复合物保持完整的衣壳形态。此外,在p H 8.0和4℃的条件下长期储存后,发现没有导致GFP-AaRS12从AaLS-switch-p H中明显释放,表明这种包封复合物在这些条件下是稳定的。先前的工作试图鉴别可以替代AaRS12的肽,使其通过AaLS-switch-p H封装蛋白质客体。通过噬菌体展示技术,筛选出一系列由12个氨基酸组成的肽,它们能够与AaLS-switch-p H的五聚体形式结合。在这些筛选出的肽中,我测试了其中两种肽将GFP包封入AaLS-switch-p H衣壳中的能力。在细胞中与GFPPD12.1共表达后,纯化的AaLS-switch-p H衣壳没有显示出明显的荧光,这表明PD12.1无法在体内将蛋白客体靶向引入AaLS-switch-p H衣壳中。此外,我也尝试了在体外将GFP-PD12.1和GFP-PD12.2包封入AaLS-switch-p H中。在GFPPD12.1或GFP-PD12.2存在下组装并重新纯化AaLS-switch-p H衣壳后,未检测到该衣壳有明显的荧光,这表明PD12.1和PD12.2在体外不能将货物蛋白引入到AaLS-switch-p H衣壳内。因此,噬菌体展示技术筛选出的肽无法作为AaLSswitch-p H的包封标签。总而言之,AaLS-switch-p H能够在体内包封AaRS12标记的客体蛋白,并且这些客
中国优秀硕士学位论文...
