关键词:
核酸适配体
纳米技术
PD-1
PD-L1
免疫治疗
摘要:
目的:PD-1和PD-L1阻断作为免疫检查点抑制疗法的主流,在肿瘤免疫治疗中占据重要地位,因此探索新的技术来进一步增强PD-1和PD-L1阻断的疗效具有重要的医学意义。本课题计划构建一种新型纳米药物,用于增强PD-1和PD-L1阻断的疗效。目前实现PD-1/PD-L1阻断的技术手段主要是抗体,而核酸适配体由于具备合成修饰简单、免疫原性低、亲和性和特异性高、制备价格低廉等优点,是一种极具发展前景的技术手段,在免疫检查点阻断方面也有应用前景。然而,游离的核酸适配体尺寸比较小,容易被肾脏滤除。由于纳米颗粒具有高渗透长滞留效应(Enhanced Permeability and Retention effect,EPR effect),可以在肿瘤组织富集,因此本课题构建了一种由PD-1和PD-L1核酸适配体共同修饰的白蛋白纳米颗粒。此种双特异性纳米颗粒有望在肿瘤组织富集的同时,通过PD-1核酸适配体与活化T细胞表面的PD-1结合,招募激活的T细胞至PD-L1阳性的肿瘤细胞周围,形成免疫突触并增强免疫反应。迄今为止,将这种双特异性纳米颗粒应用于抗肿瘤免疫治疗,尚未见文献报道。
方法:将巯基修饰的核酸适配体与白蛋白(BSA)的氨基通过sulfo-SMCC相连,用琼脂糖凝胶电泳和zeta电位评估BSA单体是否与核酸适配体连接成功;用自组装的方式,制备成四种纳米颗粒,分别为空白纳米颗粒(NP)、PD-1核酸适配体修饰的纳米颗粒(PD1-NP)、PD-L1核酸适配体修饰的纳米颗粒(PDL1-NP)、PD-1核酸适配体和PD-L1核酸适配体共同修饰的双特异性纳米颗粒(PD1-NP-PDL1)。采用动态光散射仪(Dynamic light scattering,DLS)测定四种纳米颗粒的粒径和zeta电位;利用流式细胞术和共聚焦显微镜评估双特异性PD1-NP-PDL1与细胞的结合能力;通过MTS实验,评估双特异性PD1-NP-PDL1对淋巴细胞介导的细胞杀伤效应的影响;利用相差显微镜评估双特异性PD1-NP-PDL1对招募活化的T细胞的影响;通过CT26小鼠模型,评估双特异性PD1-NP-PDL1的体内抗肿瘤疗效。
结果:巯基修饰的核酸适配体可以和白蛋白单体成功连接。NP、PD1-NP、PDL1-NP、PD1-NP-PDL1 的粒径分别为 122.4 nm、141.8 nm、141.8 nm和 164.2 nm,其zeta电位分别为-20.2 mV、-26.9 mV、-23.6 mV和-32 mV。通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测,发现双特异性PD1-NP-PDL1可以结合PD-1阳性细胞和PD-L1阳性细胞,而与PD-1阴性细胞和PD-L1阴性细胞基本不结合。通过相差显微镜观察,发现双特异性PD1-NP-PDL1可以招募活化的T细胞至PD-L1阳性肿瘤细胞的周围。体外杀伤实验发现,与游离的核酸适配体相比,PD1-NP和PDL1-NP显著增强了淋巴细胞介导的细胞杀伤;而双特异性PD1-NP-PDL1相比PD1-NP和PDL1-NP,也增强了淋巴细胞介导的细胞杀伤。动物实验发现,与游离的核酸适配体相比,核酸适配体修饰的纳米颗粒抗肿瘤作用更强。此外,与PD1-NP或PDL1-NP相比,双特异性PD1-NP-PDL1表现出更强的抗肿瘤疗效,并且无明显的毒副作用。
结论:本课题利用核酸适配体和纳米技术,构建了一种双特异性纳米颗粒PD1-NP-PDL1,在体内外都能显著增强抗肿瘤疗效,在肿瘤的免疫治疗方面具有一定的应用潜能。