关键词:
生物纳米技术
蛋白装配
蛋白-蛋白相互作用
蛋白质自我折叠
纳米容器
摘要:
分子间或分子内通过非共价键结合在一起形成的复合物为超分子。某些天然超分子通过自组装形成一种通常包括八面体、十二面体或者二十面体等不同的形状的壳结构,而这些壳结构为超分子提供了一些广泛的应用。其中之一就是用这些衣壳作为承载其他小分子的容器,包载物的衣壳在外界条件改变下将包裹的小分子释放出来发挥自身的功能,因此这些承载了外来分子的衣壳可以用在材料、酶学催化或者药物传递等多领域。酶不稳定且易降解的特点众所周知,如果用某种特定的壳将酶包裹起来就可以防止酶在发挥作用过程中外界条件对酶的影响。在药物传递领域,某些可以杀死细胞的毒性无机小分子或者生物大分子在杀死癌细胞的同时也会伤害正常细胞,如果用衣壳将其包裹,在传递的过程中就可以避免对正常细胞的伤害,到达特定靶位时释放包裹的分子,将癌细胞杀死从而提高生物性能。病毒是自然界中最常见的一种天然分子容器,使用病毒衣壳来传递药物也是近年来很常见也是很成熟的一种手段。除病毒外,许多非病毒的天然蛋白衣壳也可看作是承载小分子的容器。例如,在枯草芽孢杆菌中存在着一种由六十个亚基组成的具有十二面体衣壳结构的二氧四氢喋啶合酶(BsLS),在衣壳内部包裹着一个三聚体的核黄素合酶(BsRS)。这个复合体结构中的二氧四氢喋啶合酶和核黄素合酶在核黄素合成的过程中具有重要作用。以前的研究学习曾报道过通过改变这个复合体所在的环境,会导致衣壳结构变大从而释放出核黄素合酶。这个天然的分子包裹并轻松释放的系统也许可以启迪我们来利用这个衣壳的优势包裹某些特定的小分子并在特定靶位释放以提高专一性。近年来,除了天然的超分子包裹系统,人们也曾尝试着构建具有高效包裹能力的衣壳。其中一种曾被修饰过用来包裹小分子的衣壳折叠工程就是来自超嗜热菌中的二氧四氢喋啶合酶(AaLS),其由六十个亚基组成的内径为九纳米的十二面体聚合物。为了利用它来高效包裹外源分子,在一个修饰工程中通过氨基酸突变导致其重新组装为一个由一百八十个亚基组成的内部带有额外的负电荷扩大的衣壳,它就会优先包裹带有正电荷的外来分子。将其与在末端连有十个精氨酸短肽的HIV蛋白酶共表达,单体在成壳过程中就可以将带有正电荷的HIV蛋白酶包裹通过电荷互补作用。因此来自超嗜热菌中二氧四氢喋啶合酶为包裹装配工程提供了很有前景的应用平台。但是这个包裹系统只能通过电荷互补的方法包裹小分子,使其没有专一性;其次在氨基酸突变过程中会导致衣壳结构变大,使我们不能很清晰的了解结构内部;再次这种装配和解聚过程是不可逆的,使得包裹进去的分子不能释放,所以相比天然的枯草芽孢杆菌中的二氧四氢喋啶合酶复合体的包裹释放系统,这种天然的更值得人们利用。尽管有不少关于枯草芽孢杆菌中二氧四氢喋啶合酶复合体衣壳结构和功能的研究,但目前为止还不知道复合体内部核黄素合酶的结构,这个信息的缺少阻碍了人们去探索核黄素合酶如何被二氧四氢喋啶合酶包裹。通过比较,发现在大肠杆菌中也存在着二氧四氢喋啶合酶和核黄素合酶,与枯草芽孢杆菌中的两种酶属于两对同源蛋白,大肠杆菌中二氧四氢喋啶合酶也是由六十个亚基组成的十二面体的衣壳。大肠杆菌中核黄素合酶的结构已被报导,它是一种类似于蘑菇形状的三聚体,每个单体都包含两个β折叠和一个α螺旋,最后7个氨基酸在结构中看不到,我们猜测它是一段灵活的序列,在结构中能看到的后面21个氨基酸形成α螺旋。然而在大肠杆菌中二氧四氢喋啶合酶不能包裹核黄素合酶。比较两种核黄素合酶的氨基酸序列,尽管它们有30%的同源性,但它们的末端氨基酸序列完全不一样,而且枯草芽孢杆菌中的核黄素合酶比大肠杆菌中的同源蛋白长四个氨基酸。鉴于大肠杆菌中核黄素合酶的结构分析,枯草芽孢杆菌中核黄素合酶的最后11个氨基酸也可能是个灵活的尾巴,最后32个氨基酸也可能构成α螺旋。我们推测可能末端的α螺旋序列或者结构中看不到的那段序列导致枯草芽孢杆菌中的核黄素合酶被二氧四氢喋啶合酶包裹。因此我们的任务就是将末端的32个氨基酸以及最后11个氨基酸融合到绿色荧光蛋白,将融合后的绿色荧光蛋白与二氧四氢喋啶合酶共表达,通过荧光检测来确定衣壳合酶能否将融合了核黄素合酶标签的蛋白包裹。这个课题的目标就是探究枯草芽孢杆菌中核黄素合酶(BsRS)为什么能被二氧四氢喋啶合酶(BsLS)包裹并且利用这个天然的系统包裹外源蛋白。合成枯草芽孢杆菌中核黄素合酶的最后11个及后32个氨基酸序列,使其末端磷酸化并通过PAGE的方法纯化。选用带有十个精氨酸的绿色荧光蛋白(GFP)质粒作为模板,通过用XhoI和SpeI两种酶进行酶切,去磷酸化酶将末端的磷酸基团去掉以防止模板自连,将模板纯化后在TDNA连接酶的作用下与寡核苷酸对连接得到构建的质粒。反应得到的产物通过热击转化进入感受态细胞DH5α,将菌液涂在含有氯霉素的固体培养基平板上,在37°C培养箱过夜培养。平板上会出现多个单克隆,挑取一个