关键词:
炒炭止血
烧灰存性
黄柏炭
纳米技术
碳点
纤溶系统
血小板活性
摘要:
背景:中药炭药的临床应用历史悠久,仲景《金匮要略》中有数个处方与中药制炭相关。如王不留行散后注“桑根皮以上三味烧灰存性,勿令灰过”,枳实芍药散中注“枳实(烧令黑,勿太过)”,其所提出的“烧灰存性,勿令灰过”是最早的炭药炮制标准。目前制炭多以经验判断,临床疗效良莠不齐,炭药用于止血在历代中医用药中占有十分重要的地位,而探究“炒炭止血”关键物质基础成为炭药现代研究的重点和难点。黄柏炭(PCC)是黄柏高温炭化的产物,苦寒之性大减,清热燥湿之中兼有收涩之性,临床常用于治疗便血、崩漏下血等。黄柏含有生物碱类、柠檬苦素类等活性成分,在高温炭化后,原有的这些主要成分几乎完全消失,但却产生了止血作用。虽然PCC的止血效果得到了相当多的临床证据的支持,但其止血作用的物质基础及机制尚不明了。目的:本研究引进纳米学科表征技术,以黄柏炭为研究对象,探究新发现的存在于PCC水煎液中的黄柏炭碳点(PCC-CDs)的制备工艺标准,基于多种出血模型评价PCC-CDs的止血作用并探究其作用机制,证实PCC-CDs是黄柏高温炭化后产生止血作用的关键物质基础之一,为阐明“炒炭止血”物质基础与仲景炭药“烧灰存性”科学内涵提供部分实验依据。方法:1.建立PCC-CDs的制备方法及分离纯化方法,以白眉蛇毒血凝酶(HC)为止血阳性对照药,利用小鼠断尾出血模型初步评价PCC-CDs的止血作用。2.考察马弗炉锻烧温度及时间,运用透射电子显微镜表征技术(TEM),以电镜结果和止血效果为评价指标,优化PCC-CDs的制备条件。3.利用高效液相色谱法(HPLC)对PCC-CDs水溶液进行成分分析;运用TEM、HRTEM、EDS和XPS等技术,结合傅立叶变换红外光谱(FTIR)、紫外光谱(UV-Vis)、荧光光谱(FL)等现代中药研究常用分析技术,对优选出的PCC-CDs进行理化性质表征并计算其量子产率。4.通过细胞计数试剂盒(CCK-8)检测不同浓度PCC-CDs水溶液对细胞活力的影响,评价其细胞毒性,初步获取PCC-CDs的安全性参数。5.运用断尾出血模型考察皮下注射(sc),灌胃注射(ig)和腹腔注射(ip)3种给药方式PCC-CDs的止血效果。运用毛细玻璃管法,测定PCC-CDs单次给药后10min、45min、90min、120min、180min、300min和480min各时间点的凝血时间。采用小鼠断尾出血、肝脏损伤出血模型,考察PCC-CDs止血作用的量-效关系。通过PCC-CDs肝素钠拮抗实验及其对小鼠血小板计数(PLT)和凝血四项(PT、APTT、TT、FIB)的影响,探究PCC-CDs发挥止血作用可能的途径。6.建立五步蛇毒(AAV)急性出血模型,设对照组、模型组、PCC-CDs高、中、低剂量组,每组按时间点(1h、3 h、12 h、1d、2d和5d)设6个亚组。各组各时间点取全血检测PLT,取血浆检测6-keto-PGF1α、TXB2、t-PA和PAI-1的含量,探究PCC-CDs对AAV急性出血模型的止血作用及其作用机制。各组各时间点取血清检测BUN、CRE,取肾脏行HE染色观察肾脏病理光镜改变,以ELISA法检测肾组织中IL-10、IL-1β和MCP-1的含量,探究PCC-CDs对AAV出血致小鼠急性肾损伤的保护作用及机制。结果:1.在马弗炉300℃煅烧1h的制备条件下,所得PCC-CDs电镜下呈较均匀分散的球形,粒径小于10 nm,晶格间距约为0.24 nm。在断尾出血模型中,PCC组和PCC-CDs组的止血时间无差别(P>0.05),二者与NS组、黄柏生药组相比,止血时间均明显缩短(P<0.05),与HC组止血时间差异无统计学意义(P>0.05)。2.在PCC-CDs制备方法的考察中,马弗炉煅烧温度分别为250℃、300℃、350℃、400℃和450℃时,所得PCC的制炭产率及电镜下粒径和形状均存在差异,止血效果也不尽相同,综合电镜结果和止血效果,优选出350℃组。进一步考察350℃条件下的煅烧时间,分别为15 min、30 min、45 min和60min,综合电镜结果和止血效果优选出60min组。最终PCC-CDs的最优化制备条件为马弗炉350℃煅烧1 h。***-CDs成分分析及理化性质表征:(1)HPLC法检测PCC-CDs水溶液,未检测到存在于生黄柏中的生物碱类和柠檬苦素类等活性成分。(2)PCC-CDs的形貌:PCC-CDs在TEM下呈球形并均匀分布,直径范围为1.2-4.8nm,粒径分布为2.640±0.694 nm;经HRTEM衍射测得PCC-CDs的晶格间距约为0.232 nm。(3)PCC-CDs光谱性质:①UV-Vis显示PCC-CDs在270 nm处有一个弱吸收峰。②FL结果显示PCC-CDs的最强发射波长为438 nm,最