关键词:
黄芪桂枝五物汤
自噬
类风湿关节炎
肌少症
骨骼肌稳态
机器学习
摘要:
目的:基于网络药理学、生物信息学、机器学习及动物实验探讨黄芪桂枝五物汤通过调控细胞自噬改善骨骼肌稳态治疗类风湿关节炎(RA)肌少症的作用机制。方法:利用中药系统药理学平台(TCMSP)、PubChem与SwissTargetPrediction数据库筛选黄芪桂枝五物汤活性成分及靶点;通过GEO数据库检索RA相关数据集并筛选差异基因,GeneCards与比较毒理学数据库(CTD)检索肌少症相关靶点,人类自噬数据库(HADb)下载自噬相关基因集,取交集得到自噬相关治疗靶点,并进行富集分析;利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络并采用多重方法筛选关键靶点,借助机器学习对交集靶点相应表达谱进行模型预测构建,并基于关键靶点构建列线图模型;应用AutoDockVina对度值排名前4的活性成分与关键靶点进行分子对接。SD大鼠分为空白组,模型组,黄芪桂枝五物汤低、中、高剂量(2.44、4.88、9.76 g·kg^(-1))组,采用牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型,连续给药5周。记录并分析造模后关节评分,腓肠肌质量;苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察肌肉组织病理学变化;免疫荧光染色观察骨骼肌肌球蛋白重链(MYHC)、胰岛素样生长因子1(IGF1)蛋白表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肌肉组织中自噬相关蛋白5(ATG5)、自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)及肌肉环指蛋白1(MuRF1)、肌肉萎缩F盒蛋白(MaFbx)、MYHC蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肌肉组织中ATG5、Beclin1、LC3B、MuRF1、MaFbx、MYHC mRNA表达水平。结果:网络药理学显示,黄芪桂枝五物汤与RA肌少症自噬相关基因共有25个交集靶点,PPI与机器学习鉴定得到6个关键靶点,主要涉及自噬与炎症等相关通路。动物实验结果显示,与空白组比较,模型组的关节评分显著升高(P<0.01),腓肠肌指数显著降低(P<0.01)。HE染色结果显示模型组腓肠肌肌纤维横截面积显著减小,有明显的炎性细胞浸润及肌萎缩现象。Masson染色显示模型组腓肠肌中胶原纤维增生、沉积明显,有显著的肌纤维化病变;模型组大鼠ATG5、Beclin1、LC3B、MuRF1、MaFbx蛋白表达水平及mRNA表达水平均显著升高(P<0.01),MYHC、IGF1蛋白表达水平显著下调(P<0.01);与模型组比较,黄芪桂枝五物汤高剂量组ATG5、Beclin1、LC3B、MuRF1、MaFbx蛋白表达水平及mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),MYHC、IGF1蛋白表达水平显著上升(P<0.01);肌纤维横截面积有所增大,肌肉细胞形态趋向正常,腓肠肌病理学异常明显改善,胶原纤维增生现象显著减轻(P<0.01)。结论:黄芪桂枝五物汤能够通过调控ATG5、Beclin1、LC3B与IGF1的表达介导自噬,进而降低骨骼肌分解,改善骨骼肌稳态发挥治疗RA肌少症的作用。研究结果为黄芪桂枝五物汤治疗RA肌少症的作用机制提供了方向,并为其更好地应用于临床提供可参考依据。