关键词:
脑出血
白三烯B4
NDAPH氧化酶4
氧化应激
炎症反应
血脑屏障
摘要:
研究背景:
脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一种常见的神经科脑血管疾病,致残率和致死率极高。ICH后血脑屏障(blood brain barrier,BBB)破坏是导致继发性脑损伤的关键因素。已有研究表明炎症反应、氧化应激、神经细胞凋亡、细胞焦亡等均参与ICH后BBB破坏,其中尤以炎症反应(inflammatory reaction,IR)和氧化应激(oxidativestress,OS)对BBB破坏作用最为显著。大部分研究中对ICH后各种损伤因素的单一干预效果并不理想,因此联合干预多种机制可能为治疗ICH提供新的策略。基于前期研究成果,我们发现ICH后白三烯B4(LTB4)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的表达显著增加,且变化趋势与ICH后脑水肿程度一致。且研究证实:ICH后脑水肿的主要类型为血脑屏障破坏导致的血管源性脑水肿。因此,我们推测LTB4介导的IR和NOX4介导的OS在ICH后BBB破坏过程中发挥着重要的协同效应。本研究旨从IR、OS两方面入手,探究LTB4及NOX4在ICH后BBB完整性破坏中的作用及相关性,以及靶向两者的联合抑制对IR和OS抑制作用。
研究方法:
1.采用自体血注入脑出血动物模型。免疫组化和免疫荧光分析NOX4、LTB4表达、分布变化。RT-PCR检测NOX4与LTB4的mRNA表达变化,ELISA法检测LTB4变化情况。DCF-DA法测定ROS水平。通过比较不同时间点的数据,评估ICH后LTB4、NOX4及ROS的表达与分布变化,并探讨它们之间的相关性。
2.在脑出血大鼠模型基础上,应用LTB4选择性抑制剂SC-57461A和NOX4 shRNA慢病毒转染处理。免疫组化分析NOX4、LTB4表达变化。ELISA法检测LTB4变化情况。采用DCF-DA法、ELISA和Western blotting等方法测定脑组织 ROS水平、OS 生物标记物(3-NT、8-OHdG)、IR 细胞因子(IL-1β、TNF-α)、转录因子(NF-κB)及LTB4受体(BLT1)的表达变化,以初步探讨抑制LTB4及NOX4对脑出血后IR和OS的影响。
3.在脑出血模型基础上,联合应用LTB4抑制剂和NOX4 shRNA慢病毒转染处理。采用Western blot法检测ZO-1、occludin、MMP-9和MPO等蛋白表达;伊文氏蓝染色评估血脑屏障通透性;脑组织干湿比重法、小动物核磁共振评估脑水肿程度;借此评估BBB损伤情况;对各分组大鼠进行改良神经功能缺损Longa评分,借此分析LTB4介导的IR及NOX4介导的OS在ICH后BBB结构损伤及功能障碍过程中的协同作用。
研究结果:
1.脑出血后,NOX4mRNA、蛋白的表达与LTB4mRNA、蛋白的表达以及细胞ROS水平均显著上调,7天后同步达到峰值,随后均逐渐下降。
2.脑出血后应用LTB4抑制剂和NOX4 shRNA慢病毒转染后NOX4与LTB4的表达显著性下调。经联合抑制LTB4/NOX4处理后,IR细胞因子(IL-1β、TNF-α)、转录因子(NF-κB)和OS标志物(3-NT、8-OHdG)在3d和7d时显著下降,且效果优于单独用药。同时,该处理还能降低BLT1蛋白表达,共同表现出持续的抗炎和抗氧化作用。
3.脑出血后大鼠脑组织ZO-1、occludin蛋白表达下降,而MPO、MMP-9蛋白表达显著上升。经联合抑制LTB4/NOX4处理后,ZO-1、occludin蛋白表达上调,MPO、MMP-9蛋白表达下调,同时,还显著降低了神经功能缺损评分、脑含水量及伊文思蓝含量,有效保护了血脑屏障,减轻了脑水肿,改善了神经功能。
研究结论:
***4、NOX4在ICH后出血部位及其周围组织高表达,并诱导了其下游ROS水平的上调,其时程依赖性表达模式基本一致。
2.抑制LTB4可下调NOX4的表达,NOX4 shRNA慢病毒转染可下调LTB4的表达。联合抑制LTB4/NOX4可有效控制ICH后的的IR及OS,且联合抑制具有协同效应,提示了靶向上述途径的药物治疗在ICH治疗中的潜力。
***4介导的炎症反应和NOX4介导的氧化应激是ICH后BBB结构损伤、脑水肿及神经功能障碍发生发展的重要促进因素,联合抑制LTB4/NOX4可明显改善ICH后大鼠BBB损伤并挽救ICH大鼠的神经功能。为ICH治疗的新的靶点提供了理论依据。