关键词:
CXCL3/CXCR2信号轴
脑出血
炎症反应
PKA/CREB通路
摘要:
目的:
本研究旨在通过细胞实验以及构建SD大鼠ICH模型两种方式为基础,探讨CXCL3及其受体CXCR2在ICH后的表达动态、细胞定位及其对神经炎症反应的影响。通过分子生物学及行为学检测,系统分析CXCL3/CXCR2轴在ICH后炎症反应、神经元凋亡中的作用机制,以期为ICH的抗炎治疗及神经保护策略提供新靶点和理论依据。
方法:
1.揭示ICH后CXCL3和CXCR2表达改变:(1)对正常脑组织(5例)和ICH患者(5例,发病24小时内)血肿周围组织的RNA-Seq数据进行KEGG富集分析,进行差异基因分析。(2)体外培养星形胶质细胞(astrocyte,AS)、小胶质细胞(microglia,MG)、神经元(neuron,Neu),构建出血模型,采用免疫荧光共染色定位的方法,在出血模型中检测CXCL3和CXCR2的表达,并分别与星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元标志物进行共染,以确定CXCL3和CXCR2主要表达的细胞类型。(3)体外培养星形胶质细胞和神经元细胞,构建不同浓度血红蛋白的细胞分组,采用q RT-PCR检测方法比较Contrl组和Hemoglobin组CXCL3和CXCR2的表达变化。(4)建立SD大鼠ICH模型,取不同时间点(1d、3d、7d)血肿周围脑组织,采用q RT-PCR、Western Blot、ELISA等实验技术进行分析CXCL3和CXCR2表达改变。
2.干预CXCL3/CXCR2信号轴对脑出血后神经功能恢复的影响:重新建立SD大鼠模型,任选75只,随机分为A、B、C三大组,A组分4小组,B组分3小组,C组分4小组,共11组,其中A组包括:1)假手术组(sham组作为对照组,只针刺不注血,模拟大鼠脑出血的造模过程);2)ICH+vehicle组,建立SD大鼠ICH模型成功1小时后,腹腔注射PBS缓冲液;3)ICH+SB225002 1mg/kg组,建立SD大鼠ICH模型成功1小时后,腹腔注射CXCR2拮抗剂SB2250021mg/kg;4)ICH+SB225002 3mg/kg组,建立SD大鼠ICH模型成功1小时后,腹腔注射CXCR2拮抗剂SB225002 3mg/kg;B组包括:1)Navie+vehicle组,在SD大鼠生理状态下脑室内注射PBS缓冲液,作为对照;2)Navie+r CXCL3 1ug/rat组,在SD大鼠生理状态下每只脑室内注射重组CXCL3 1ug;3)Navie+r CXCL32ug/rat组,在SD大鼠生理状态下每只脑室内注射重组CXCL3 2ug;C组包括:1)Navie+vehicle组,在SD大鼠生理状态下脑室内注射PBS缓冲液,作为对照;2)Navie+r CXCL3 2ug/rat组,在SD大鼠生理状态下每只脑室内注射重组CXCL32ug;3)Navie+r CXCL3+SB225002组,在SD大鼠生理状态下每只脑室内注射重组CXCL3 2ug,腹腔注射CXCR2拮抗剂SB225002 3mg/kg;4)Navie+r CXCL3+DMSO组,在SD大鼠生理状态下每只脑室内注射重组CXCL32ug,腹腔注射DMSO作为空白溶剂对照。以上11组大鼠,在24小时之后对大鼠进行神经功能评分,采用q RT-PCR检测血肿周围脑组织CXCR2、TNFα、IL-1β的表达,ELASA检测CXCL3表达情况、应用TUNEL检测神经元凋亡情况。
3.脑出血后抑制CXCR2激活PKA/CREB通路:重新建立SD大鼠模型,任选45只,随机分为5组,每组9:1)假手术组(sham组作为对照组,只针刺不注血,模拟大鼠脑出血的造模过程);2)ICH+vehicle组,建立SD大鼠ICH模型成功1小时后,腹腔注射PBS缓冲液;3)ICH+SB225002 3mg/kg组,建立SD大鼠ICH模型成功1小时后,腹腔注射CXCR2拮抗剂SB225002 3mg/kg;4)ICH+SB225002 3mg/kg+666-15 10mg/kg组,建立SD大鼠ICH模型前30min,腹腔注射CREB抑制剂666-1510mg/kg,ICH建模1小时,腹腔注射CXCR2拮抗剂SB225002 3mg/kg。5)ICH+SB225002 3mg/kg+DMSO组,建立SD大鼠ICH模型成功前30min,腹腔注射空白溶剂DMSO,ICH建模1小时,腹腔注射CXCR2拮抗剂SB225002 3mg/kg。以上5组大鼠,在建模24小时之后对大鼠进行神经功能评分,采用q TR-PCR检测检测血肿周围脑组织TNFα和IL-1β,El ASA、Western Blot检测血肿周围脑组织PKA Cα、P-CREB、CREB、NLRP3炎症蛋白小体的表达,并应用TUNEL检测神经元凋亡情况。
结果:
1