关键词:
脑梗死
缺血再灌注
单细胞测序
小胶质细胞
运动干预
摘要:
研究目的:
本研究旨在探讨缺血性脑卒中后单细胞水平的转录变化及细胞空间分布特征,评估有氧运动干预对炎症反应的影响,并揭示其通过调控小胶质细胞介导的炎症反应发挥神经保护作用的分子机制,为有氧运动防治缺血性脑卒中提供实验依据。
研究方法:
1.对小鼠缺血性脑卒中后不同时间点的单细胞RNA测序(Single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)数据进行分析,观察缺血再灌注后不同时间点细胞水平的变化及细胞的空间分布特征。通过差异基因富集分析,评估生物功能变化。
2.对小胶质细胞进行深入分析,鉴定与缺血再灌注相关的小胶质细胞亚群,并确定其标志基因和关键基因调控网络。进一步验证该小胶质亚群在其他缺血性脑卒中相关数据中的存在及其生物学功能。
3.分析不同年龄接受运动干预的小鼠大脑scRNA-seq数据,探讨运动干预对不同年龄小鼠大脑小胶质细胞亚群的影响。
4.将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham)、疾病对照组(Control)和运动干预组(Exercise)。所有小鼠在手术前接受3天的适应性训练以熟悉跑步机环境,排除未能完成适应训练的小鼠。Control组和Exercise组小鼠接受短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)手术,Sham组小鼠除结扎血管和插入线栓外,其他操作相同。运动干预从tMCAO手术后第1天开始,Exercise组小鼠在跑步机上进行有氧运动,运动强度设定为10 m/min,持续30分钟/天,连续干预7天。Sham组和Control组小鼠则在相同时间内置于跑步机上但不运动。取材前1小时,通过神经功能评分和平衡木测试评估小鼠的神经功能变化,使用血流成像仪检测各组小鼠局部脑血流变化。禁食不禁水12小时后,取出脑组织并通过TTC染色计算各组脑梗死区域体积。使用多重荧光染色技术(Tyramide Signal Amplification,TSA)检测各组小鼠缺血半暗带中的神经元、小胶质细胞及P-P65的表达,分析各组神经元状态及小胶质细胞的增殖与活化。通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测缺血半球炎症因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的mRNA水平,评估运动干预的抗炎效果。
5.体外实验中,使用氧-葡萄糖剥夺/复灌(Oxygen-glucose deprivation/Reperfusion,OGD/R)处理BV2细胞模拟缺血再灌注对小胶质细胞的影响,并选择JSH23作为P65磷酸化的抑制剂。细胞分为对照组(Control)、氧-糖剥夺/复灌组(OGD/R)及氧-糖剥夺/复灌联合JSH23处理组(OGD/R+JSH23)。通过qPCR检测各组细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平,Western blot分析P65磷酸化水平。收集各组BV2细胞条件培养基,分别与SH-SY5Y细胞共培养24小时后,通过死活染色评估SH-SY5Y细胞的生存状态。
研究结果:
***手术后,小鼠在急性期表现出小胶质细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞比例增加,以及神经元比例下降,提示炎症激活、血脑屏障功能障碍和神经损伤的发生。富集分析进一步表明,脑缺血再灌注后补体系统被激活,同时炎症反应和吞噬作用增强。
2.进一步分析小胶质细胞亚群发现,脑缺血再灌注后稳态小胶质细胞(Tmem119+、P2ry2+、Hexb+)比例显著下降,而疾病相关小胶质细胞(Spp1+、Csf1+、Lgals3+)比例显著升高,并在梗死灶和半暗带区域大量浸润。
3.拟时序分析与基因调控网络推断结果显示,与NF-κB信号通路相关的关键转录因子Rela(P65)在小胶质细胞向疾病相关表型转变过程中起重要作用。
4.在不同年龄的小鼠中,运动干预对大脑室下区(Subventricular zone,SVZ)细胞组成产生显著影响。与静息对照组相比,运动不仅增加了年轻和老年小鼠SVZ中神经祖细胞和成神经细胞的比例,还减少了小胶质细胞的比例。富集分析结果进一步表明,运动可抑制过度激活的补体系统,从而发挥神经保护和抗炎作用。
5.与年轻小鼠相比,老年小鼠大脑及SVZ区域疾病相关小胶质细胞比例显著升高,而运动干预可部分逆转因衰老导致的疾病相关小胶质细胞增加,发挥抗炎效果。
6.行为学评分及TTC染色结果证实,tMCAO手术后24小时实施为期一周的有氧运动干预可改善神经功能,并减少脑梗死体积。脑血流成像结果显示,运动干预可恢复部分半暗带区域的血流。TSA染色结果表明,缺血核心区及半暗带区域神经元大量