关键词:
脑出血
毛蕊花糖苷
Toll样受体4
炎症
小鼠
摘要:
目的探讨毛蕊花糖苷(VB)对脑出血(ICH)小鼠的脑保护作用及其是否与抑制Toll样受体4(TLR4)介导的急性炎性反应有关。方法采用8周龄C57BL/6雄性小鼠进行研究,其中野生型40只,TLR4基因敲除(TLR4^(-/-))20只。按照完全随机方法将野生型小鼠分为假手术组、ICH组,ICH后VB治疗组(ICH+VB 15 mg/kg或30 mg/kg),将TLR4^(-/-)组小鼠分为TLR4^(-/-)+ICH组和TLR4^(-/-)+ICH+VB(30 mg/kg)组,每组小鼠均为10只。采用右侧纹状体注射细菌胶原酶Ⅶ的方法构建ICH模型。模型建立成功(改良Garcia评分≤10分)后分别于小鼠腹腔注射VB(15 mg/kg或30 mg/kg)或等体积生理盐水,1次/d,连续3 d。采用改良Garcia评分评价脑功能损伤情况;取脑组织切片后计算脑血肿面积以评估出血量,采用干湿比法计算脑组织含水量;采用TUNEL染色法检测脑组织细胞凋亡率;采用免疫荧光染色(IF)法检测脑组织Iba-1的相对表达量;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验和蛋白质免疫印迹法(WB)检测TLR4及其下游炎症介质[核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)1β及IL-6]的表达。比较野生型小鼠组间及TLR4^(-/-)小鼠组间上述指标的差异。取出生2 h内的TLR4^(-/-)乳鼠皮质组织培养原代神经元,采用Transwell小室将神经元与小鼠小胶质细胞株(BV2细胞)共培养,并分别用红细胞裂解物及红细胞裂解物+VB(50μmol/L)处理24 h,采用IF法观察神经元NeuN蛋白的表达。结果与ICH组相比,VB治疗组(尤其是ICH+VB 30 mg/kg组)小鼠的致良Garcia评分均显著升高(均P<0.05);假手术组、ICH组、ICH+VB 15 mg/kg组、ICH+VB 30 mg/kg组脑出血量分别为0 mm^(3)、(7.33±1.99)mm^(3)、(3.19±0.47)mm^(3)、(1.66±0.26)mm^(3),脑组织含水量分别为(79.00±0.50)%、(85.00±0.75)%、(81.50±0.50)%、(80.25±0.25)%,神经元的凋亡率分别为(4.8±2.0)%、(38.7±6.8)%、(21.5±6.9)%、(9.8±4.2)%,差异均有统计学意义(均P<0.05)。IF结果显示,ICH组脑组织Iba-1的相对表达量明显高于VB治疗组(均P<0.05)。qRT-PCR和WB结果显示,与ICH组比较,VB治疗组的TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA和蛋白的相对表达量均降低(均P<0.05)。TLR4^(-/-)+ICH+VB组与TLR4^(-/-)+ICH组比较,改良Garcia评分、脑组织含水量、神经元凋亡率的差异均无统计学意义(均P>0.05)。与BV2细胞共培养的TLR4^(-/-)乳鼠神经元加入红细胞裂解物与加入红细胞裂解物+VB处理后NeuN蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.872)。结论VB可改善ICH后小鼠的神经功能缺损,减少ICH量、减轻脑水肿程度及抑制细胞凋亡,其机制可能与通过抑制TLR4信号通路,减少小胶质细胞的激活以及促炎细胞因子的释放有关。